采用 311-A最优回归设计, 对落叶松胚性细胞诱导中激素种类与浓度优化筛选, 建立胚性愈伤组织量依 2, 4-D、BA、KT的多项式回归方程。分析了试验因子的主效应和互作效应, 借助此方程获得了 3因子的最佳配比组合以及最佳胚性愈伤组织发生量。 2, 4-D为 1.2 9mg· L-1、BA为0.39mg· L-1和 KT为 0.58mg· L-1时, 落叶松胚性愈伤组织的诱导量可达到 13.9317mg·个-1(外植体)。

以落叶松扦插生根率存在显著差异的2个全同胞优良无性系茎和根为材料, 应用抑制消减杂交技术构建了扦插生根过程中2个差异表达cDNA 文库, 酶切效率检测、连接效率检测、差减效率检测结果表明: 这2个落叶松扦插生根过程差异表达cDNA 文库构建成功。利用PCR扩增和点杂交试验筛选阳性克隆, 将阳性克隆测序, 并经生物信息学分析, 最终获得521个Un iEST。

以落叶松未成熟合子胚诱导的16个胚性细胞系为材料,对继代培养的细胞系间及不同世代间染色体数目和体细胞胚胎发生率进行对比研究,结果表明:落叶松胚性细胞系随继代培养时间的增加,总体体细胞胚分化能力逐渐下降,平均体细胞胚分化率从继代培养第7次后的335.6个·g -1降低到第22次后的268.2个·g-1,细胞染色体数目变异率逐步增加,从5.4%上升到40.0%;不同细胞系间体细胞胚分化能力及稳定性差异明显,分化能力较高的细胞系染色体数目变异几率相应较小,在继代培养第25次后,细胞系a214染色体数目变异率为0%,体细胞胚分化率为416.1个·g -1。

以落叶松体细胞胚胎发育8个阶段的材料构建小RNA文库,进行了Solexa测序、miRNA鉴定、靶基因预测、qRT-PCR定量分析等研究。结果表明:发现的87个miRNAs中,29个为针叶树特异的,来自12个家族,分别为miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、miR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704,其中25个长度为22nt,且在小RNA文库中的最低拷贝数为18(miR1311),最高拷贝数为33 009(miR950)。发现12个miRNA家族的34个靶基因可能参与生长发育、抗病、AGO反馈调节等多方面遗传调控;qRT-PCR分析表明:72% miRNAs表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚,在中期子叶胚最低,最高峰在后期子叶胚,分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合,而miRNA前体的表达模式不同于miRNA,前体变化幅度小于成熟体。

以青海青杨茎段为外植体进行组织培养,研究了不同浓度激素对其再生的影响,建立了其高效的组培再生体系。结果表明:青海青杨在不定芽分化、试管苗伸长和增值以及试管苗生根的各阶段对培养基中激素的浓度反应较敏感,激素浓度低或高都会给试管苗生长带来很大影响。通过研究筛选,得到了青海青杨生长各阶段最佳的培养基:诱导茎段分化最佳的培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1,其分化率82.0%;伸长及壮苗效果最好的培养基为MS+NAA0.005 mg·L-1;增殖效果最好的培养基为MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1;生根效果最好的培养基为1／2MS+IBA0.3 mg·L-1。

以2年生日本落叶松实生苗为材料构建其小RNA文库,对283个克隆进行PCR验证后测序,通过生物信息学分析鉴定文库中的microRNA并进行qRT-PCR验证。结果表明:(1)小RNA文库的体积为50 mL,总库容量为5.25×106 cfu,重组率为92.6%,插入片段长度约65 bp,与小RNA连接片段长度吻合。(2)去除rRNA(86个)、tRNA(14个)等非目的序列后,获得日本落叶松28个保守miRNAs,属于17个miRNA家族;其中,15个miRNAs(miR159c、miR160a、miR162a、miR164b、miR165a、miR166a、miR166a*、miR166b*、miR169a、miR169b、miR171a、miR171b、miR172a、miR319b、miR396a)的序列与其它植物完全一致,其余13个miRNAs(miR156a、miR159a、miR159b、miR164a、miR166b、miR168a、miR169b*、miR319a、miR396b、miR408、miR482a、miR2111、miR3701)则高度相似。(3)测序结果与本室落叶松转录组数据进行序列比对,新发现4个miRNAs (lle-miR1、lle-miR2、lle-miR3、lle-miR4)及其前体。(4)qRT-PCR验证表明,miR159a、miR159b等16个保守的和lle-miR1 lle-miR4等共20个miRNAs存在于日本落叶松中。(5)通过靶基因预测及UniProt数据库分析发现,32个miRNAs中有24个对应69个靶基因,其功能主要为转录因子、信号转导、胁迫抗性和代谢相关酶及未知功能蛋白。

本研究克隆了日本落叶松体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶基因 LaSERK1，并检测了在不同培养条件下LaSERK1的表达情况，发现LaSERK1与已发现的其他物种SERK1 基因有高度相似性，qRT-PCR结果显示： LaSERK1在体胚发生早期高表达。结果表明：LaSERK1可能在落叶松体胚发育早期起重要作用，LaSERK1 也可能成为早期胚性细胞的标记基因。

本研究针对日本落叶松(Larix kaempferi (Lamb.) Carr.)体细胞胚胎发育过程中原胚团时期到胚胎成熟时期、种子萌发过程、植株幼年生长阶段和成年生长阶段等生长发育过程中的31份材料,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,分析了12个持家基因(ACT 4、APm、Chc、Gapc、RPL1、RPL2、EF1、EF2、eIF、E3UL、UBQ和UPL2) 在这31份材料中的表达情况。经geNorm和NormFinder两种分析软件对这12个持家基因进行表达稳定性分析,结果表明:APm在不同器官、体细胞胚胎发育和种子萌发过程中表达均最为稳定;EF1 在不同生长年龄植株的顶梢中表达最为稳定;eIF在不同年龄植株的针叶中表达最为稳定。分析结果表明,针对不同的研究材料和发育阶段应选择适合的持家基因做内参基因使用。进行基因表达细微差异研究时,可根据需要使用2个或2个以上内参组合。

运用qRT-PCR技术,检测日本落叶松种子萌发过程中的5个阶段——干种子 (萌发培养0 d)、吸胀(1 d)、萌动(5 d)、胚根外露(9 d)和子叶展开(28 d),miR156、miR159和miR160等18个miRNAs在其种胚内的表达模式,并对其目标基因进行生物信息学分析,探讨miRNA在针叶林木种子萌发过程中的基因表达模式。结果表明:(1)从整个萌发过程分析,18个miRNAs的表达水平皆以干种子阶段最高,吸胀和萌动阶段迅速下降;干种子阶段的表达水平分别是吸胀、萌动、胚根外露和子叶展开阶段的4.8 43.5、17.2 1 000.0、45.5 1 000.0、62.5 1 862.2倍。(2)从各个阶段分析,miR894的表达水平在5个阶段均最高,miR408均最低;其余16个miRNAs在5个阶段内的表达水平各有变化,综合排序结果从高到低依次为:miR951、miR950、miR156、miR159、miR396、miR398、miR390、miR160、miR947、miR165、miR319、miR162、miR171、miR397、miR395和miR172。(3)miRNA目标基因预测结果显示:目标基因主要是ATP/DNA结合蛋白、ARF等转录因子、质膜和核糖体等细胞组分及MAP等激酶活性蛋白等蛋白编码基因。(4)miR160对其目标基因JR160237 具有切割作用,切割位点发生在miR160与目标基因互补结合位点第10与11位碱基之间。JR160237在种子吸胀阶段表达水平迅速升高,在萌动、胚根外露和成苗阶段有所回落。

利用qRT-PCR技术分析了5个miRNAs(cin-miR157a、cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b和cin-miR396a)及其靶基因在中间锦鸡儿(Caragana intermedia)不同发育阶段不同器官的表达变化。结果显示,5个miRNAs的表达模式均存在时空特异性,其中cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b、cin-miR396a在成年期营养器官中强烈表达,在幼年期和成年期生殖器官中弱表达;cin-miR157a在幼年期和成年期生殖器官中强烈表达,在成年期营养器官中弱表达。除cin-miR159a的靶基因MYB和cin-miR165a的靶基因HD-Zip Ⅲ外,其它被检测的miRNAs靶基因与相应的miRNAs的表达呈现出明显的相互消长的表达模式。该结果表明中间锦鸡儿miRNA可通过调控其靶基因的表达,进而调控发育阶段转变、器官形态建成、细胞分化等生物学过程。研究结果将为中间锦鸡儿的定向改良工作提供理论依据和基因资源。